本文主要内容来自Jen-Yi Lee和Maiko Kitaoka论文“A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments”，内容有删减。荧光光学显微镜是研究细胞生物学机制不可或缺的方法。随着荧光蛋白和超分辨率显微镜等尖端工具的发展，光学显微镜比以往任何时候都更强大，可以深入了解从细菌裂变到癌症转移。然而，与所有实验方法一样，必须确保可靠和可重复的数据收集、分析和结果呈现。成像实验的每一步，从实验设计开始，到图像采集，处理，分析，结果呈现以及数据管理都应该严格评估偏差、严谨性和可重复性。这里试图给出一个基本的指南，避免荧光成像实验中常见的陷阱，更有效的进行科学交流。实验者在设计成像实验时，有很多地方易引入偏差。这些偏差是降低实验可重复性的主要因素，因为它可能导致数据采集、分析和结论出现错误。那么，如何消除或减少这些偏差？首先是选择感兴趣的区域。即选择要分析的具有“代表性”的区域。感兴趣区域（ROI）的选择对可重复性有最直接的影响，有许多方法可以减少这一过程中的偏差。例如，在多孔板的细胞进行成像时，可以选择随机位置，防止无意的偏差。另一种方法是通过在整个孔或皿内通过拼图来增加采样面积，通过采集更多样本来消除任何选择偏差。图1 选择固定位置的样品（A）和随机选择样品位置（B），或者通过拼图增大采样面积（C）另一方面，在对整个生物体或组织进行成像时，要考虑是否需要对相同区域进行对比成像，或者是否应采集更多不同的区域——用来作为对照或者平行实验。此外，研究人员可以通过用代码标记样本——盲法实验（Blinded Experiment），来减少采集过程中可能产生的偏差。而且在实验开始之前，只要统一实验方法，通过团队合作可以增加数据量来减少偏差。例如，在团队中，每个研究人员可以分工，一个人准备样本，另一个人获取图像，第三个人图像处理和分析。分工与盲法实验相结合时能很好的避免偏差。另一个导致偏差的因素是事后采集或分析（post hoc）。当实验过程中产生了新发现，人们可能因为希望实验产生积极结果或项目成功的愿望——这种行为也被称为数据发掘（P-hacking），不自觉的以支持新发现的方式收集或处理数据。避免这种偏差的最好方法是在实验前建立严格的采集和分析流程。可以使用一组预试验来确定成像和分析工作流程的细节，例如如何选择和获取ROI、需要哪些对照组、如何处理图像、需要多少样本数量以满足统计学要求，以及将进行哪些分析。
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对照组样品无自发荧光，而且没有进行转染，抗体标记或染色
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尽量减少滤片组的切换，以防止由于机械振动引起的图像晃动
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在图像分析之前，仔细检查软件设置参数：如比例尺、采集参数、采集时间等
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使用正确的盖破片（绝大部分显微镜物镜要求1.5#盖玻片也就是厚度0.17 mm），当然可以使用带有校正环的物镜，这样可以根据样品厚度来调整。
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遵守Shannon-Nyquist定律获得最佳空间和时间采样率
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注意采集环境一致性，如温度、二氧化碳浓度、湿度、PH和气体循环等
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要注意的是预试验测试可以用于创建实验流程，但不应该算作正式实验的结果。另外在实验设计阶段，生物学家需要了解如何使用数据统计，而统计学家一般只根据数字进行统计分析，不会期望某个特定研究结果，比较客观。一个简单的建议，让生物学家与生物统计专家合作，来有效阻止事后分析。对于成像的严谨性和可重复性，研究人员应该了解显微镜控制，硬件/软件校准，如何获得定量图像，以及如何保持成像的一致性。然而，由于样本（细胞、组织、生物体）、成像方式、显微镜配置、采集软件和实验目的的巨大差异，并没有一种适合所有情况的图像采集方案。正如前文提到的“图像采集时需要考虑的内容”，图像采集时选择适当的参数是关键，不仅对于特定的实验条件，而且对于技术成像参数，如调整背景或自发荧光和环境因素。还必须考虑图像的分辨率和质量，这可以通过修改显微镜软件中的采集设置来解决。例如Shannon Nyquist采样定律是一个关键的参数，因为它会极大地影响图像的空间和时间分辨率（图2A）。一般来说，适当的Shannon Nyquist采样率至少是空间或时间分辨率极限的两倍。在本例中，成像软件根据物镜参数和光波长计算出Shannon Nyquist采样率，确定3488×3488像素比为最佳图像分辨率。当然也要注意实际图像呈现的过程中，如果无需放大呈现，那么选择较低的成像分辨率也是可以的，对于共聚焦成像来说可以减少成像速度和荧光漂白。其他的关键参数，例如，相机成像的曝光时间，一般越长信号越亮，但也可能提高了背景荧光，反而造成信噪比下降，而且影响成像速度。所以在弱信号时，除了曝光时间还可以调节相机的增益（gain），部分相机还具有像素合并功能（binning）——可以减少曝光时间，但是会影响图像分辨率。 图2：适当的采样对于获得高分辨率数据至关重要。用Alexa Fluor 488和568对非洲爪蟾9期（7 hpf）胚胎进行微管蛋白和组蛋白H3染色。（A）最上一行为全视野图像，比例尺= 50 μm；由白色框标记显示一个放大的感兴趣区域（ROI），比例尺= 20 μm。左边的图像是512像素512像素，右边的图像使用Shannon-Nyquist采样在3488 3488。左下角的图像是欠采样的例子。（B）左侧为获取的原始图像。右侧显示一个增强显示后的图像，其中增加了两个通道的亮度，以增加能见度。无论使用何种成像参数，要考虑到成像的实际目的和样品情况，更重要的是要保证成像参数的一致性。因此，一些小细节也需要考虑。例如，参数调节时应该以亮度较高的样品（如阳性对照），作为调节基础，来避免成像过程中可能出现的过曝问题。图像处理中最常见的错误是操作不当，例如，处理方法不统一或选择性处理，或随意地改变原始值。滤波（Filter）、阈值（Threshold）和掩膜（Mask）在图像处理过程中非常有用，但是，任何变化都应该以相同的方式应用于实验的所有图像，并且详细记录具体的处理步骤。研究人员常犯的一个错误是改变图像的原始值。每个像素都有一个强度值称灰度值，灰度值的范围是由比特位（bit）定义的，称为灰阶。大多数显微镜图像是8、12或16位灰阶，例如8位灰阶有28 = 256灰度范围，而16位像素有216 = 65,538灰度范围。灰阶是由检测器（相机或光电倍增管PMT）在采集时设置的，也可以在采集后更改。但是，采集后更改不会产生更高质量的图像。因此，如果定量成像，那么在采集前设置所需的灰阶是必要的。虽然图像采集和分析软件中的工具有助于图像展示，但对于分析来说，最重要的是对原始文件（或对原始文件处理后的文件）进行分析，以原始格式保存，避免使用一些压缩格式保存图像数据，例如JPEG。获取的原始图像不需要看起来很漂亮，可以在对图像进行分析和处理后进行调节（图2B）。在准备出版或展示的数据时，可以使用图形软件来调整亮度和对比度等定性方面。只要图像处理过程相同，那么仍然真实反映了原始图像中的定量数据结果，这些处理过程仅仅为了强调图像细节，帮助读者理解实验结果而已。当使用为科学图像处理和量化设计的软件时，理解各种滤波或宏背后的原理是必要的。大多数软件包会附带有用的参考资料。例如，ImageJ/FIJI有一个论坛和用户文档，允许研究人员了解所有的插件（http://forum.imagej.net/）。商业软件包通常有在线教程或远程技术支持。当然，你也可以在研究团队内部寻求帮助。在许多情况下，与专家合作是最好的选择。
关于荧光成像，除了上述的内容还有很多，例如，图像的结果如何清晰并正确地呈现给对方，如何管理成像结果和分析结果。当然还要注意实验方法的交流方式——这是让后来者了解你的实验的关键，也是实验可重复性的重点。
执行严格的成像实验只是一半；另一半是将你的方法传达给学术界。一个完整和透明的方法介绍是实验可重复性的关键。详细记录图像采集、处理和分析参数是必不可少的。还有一些在线工具鼓励实验步骤共享和反馈，而且，许多期刊已经取消了方法部分的字数限制，这样研究人员就可以尽可能阐述清楚。此外，一些新的工具，如研究资源标识符（rrid；https://scicrunch.org/resources）通过系统地分配抗体、生物类型、细胞系和工具（包括显微镜）的唯一标识符，使研究人员使用统一的方法语言，方便研究方法追溯。尽管有了这些改进，但挑战仍然存在，主要是源于习惯或缺乏意识。首先，许多研究人员忽略了公认的方法步骤。例如，热处理胎牛血清（FBS）来阻断抗体，或者在每次实验中使用新鲜的固定剂，这些步骤可能对实验的成功至关重要。一种解决方案是让实验室的另一名成员重复之前实验记录的步骤，并尝试重现结果。在这个过程中，任何遗漏的步骤都将变得很明显。其次，没有足够详细的成像、处理、分析和统计参数或操作步骤的文档，导致实验无法重复。最后，陷入参考文献的黑洞是很常见的，即引用一篇论文的方法，该方法引用自另一篇论文，而它又引用自另一篇论文——引用最好来自初始文献，而不是二次引用。同时也要详细阐述你的方案，这样其他人就可以立即了解你所做的工作，而无需搜索其他研究论文。下面显示了方法部分中应包括的内容。
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物镜：制造商，放大倍数，数值孔径，是否浸没物镜，校正环（如果有的话）
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其他硬件，如电动载物台，活细胞培养室，Peizo载物台或物镜
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②是否像素合并（binning），增益（gain）
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每个转染和抗体染色方案，包括使用的质粒结构，抗体制造商和抗体浓度
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制图的软件，包括处理步骤（版本，亮度和对比度，最大强度投射（MIP）等）
为了确保成像实验方案的可重复性，可以通过实验室成员或第三方重复你的方法，请他们指出需要记录的实验方案内容。此外，如今大多数采集软件程序能够自动创建元数据并嵌入每个图像，其中包括大多数重要的成像参数，只需要保存好原始文件就能看到这些内容——再次说明保存原始文件的重要性。图3 图像原始数据包含的元数据（metadata）最后，如果使用多步处理或分析，建议有基础的用户可以使用宏或自定义代码跟踪图像处理，普通用户可以保存多个版本的图像（文件名中包含处理细节），或使用简单的“README”文本文件记录处理步骤。通过数据图像能够有效传达结果，但是错误的展示也会影响结果的真实性。以下是一些关于如何正确地呈现出版图像的建议。与处理类似，任何图像调整（例如亮度/对比度）都应该应用于整个图像。从图像中添加或删除特定的对象（例如，细胞，灰尘）都是错误和不道德的。在图像呈现方式上，荧光图像的颜色选择，首先应该考虑对比度。灰度图是最容易看到的，而蓝紫色是最糟糕的，因为人眼针对该范围的灵敏度较低。另一个关于灰度图的论点是，人类对颜色的感知通常是非线性的，使用伪彩图像传递强度信息可能不那么有效。出于对色盲同事的考虑，应避免红/绿配色——因为大多数色盲为红绿色盲。品红Magenta，绿色Green，青色Cyan，黄色Yellow是一个日益流行的多通道图像伪彩选择。低强度荧光图像可以考虑图像反转（inversion），使信号在白色背景上呈灰色/黑色（Johnson, 2012）。这对于演讲或海报展示时，头顶有灯光却不能调暗时特别有用（图4 inverted）。图4 对比不同显示效果。GFP-v-SNARE在酵母细胞对交配信息素反应的原始图像（A）和不同调节显示方式（B-F）图像。自动缩放动态范围（B）通过将中间灰度值（B，箭头）设置为白色，在整个显示范围内重新分配像素值，而不丢失空间信息。对比度可以进一步拉伸（C），但在上限以上范围内的灰度值会被剪切（C，星号），丢失最亮区域的空间信息。非线性指数变换（D和E）根据指数γ的对数公式重新分配灰度值，从而增加了灰度值子集的对比度。反转（F）将暗值显示为亮，反之亦然，而不改变像素强度的分布。此外，颜色编码（又称热图）可以更容易地传递信息，如强度差异、饱和度和深度（Z轴层扫）。 
图5 颜色编码和伪色。对比灰度（B）展示，颜色编码（A）通过将灰度值表示为不同的颜色色调来增加视觉敏感度。伪色（D-F）将单一纯色应用到灰度图像（C），从而产生由颜色亮度表示的灰度级别。
最后，在呈现多通道图像时，最好是在每个通道各自显示灰度图，最后是一个合并的多色图像（图6）。
图6:对于多通道图像，每个通道分别以灰度表示，合并后的图像使用颜色。牛肺动脉内皮（BPAE）细胞用DAPI染色标记DNA, Alexa Fluor 488 phalloidin标记肌动蛋白微丝（Thermo Fisher;FluoCells制备幻灯片#1）。比例尺= 20 μm。每张图应该包含至少一个比例尺。比例尺应该在一组图像中保持一致，但是放大区域时需要随之改变比例尺。发表的文章中展示图像数据有两个挑战：显示三维数据和时间序列图像。对于3D数据集，有些人选择将3D图像进行最大强度投影（MIP）。虽然投影可以呈现3D结果，但深度信息会丢失（图7A）。此外，根据MIP的算法，它可能是信号强度的不准确表示（即，所有平面的最强像素点叠加）。为了更好地表示Z轴维度，可以使用深度颜色编码来表示每个像素在Z堆栈中的位置（图7B）。或者，通过成像软件（如Bitplane Imaris, Arivis Vision4D）进行3D重构，可以将3D投影、高光和阴影引入2D图像（图7C）。图7:三维数据的呈现形式。在共聚焦显微镜上使用20 /1.0 NA水浸物镜对一只未染色的果蝇黑胃眼（Carolina Biological Supply Company）进行成像。在488 nm氩激光激发下，检测到GFP通道的自发荧光。获得了一个60 μm厚（89层）的z轴层扫。（A） 的最大强度投影（RRID:SCR_013672）。（B） 深度颜色编码，蓝色表示相对物镜最表面深度，红色表示最深处（60 μm）。（C）使用Bitplane Imaris软件（RRID:SCR_007370）生成的倾斜3D的效果。比例尺= 50 μm。对于时间序列图像，可以将关键的时间点呈现为单独的面板。图7 活细胞时间序列显示HeLa-H2B-GFP细胞有丝分裂进程以分析结果的方式呈现数据可能更有效，例如使用kymograph来分析和显示轴突的囊泡运动（Chiba et al.， 2014）。图8 从时间序列成像数据生成kymograph的示意图现代光学显微镜获取图像几乎完全是通过软件程序完成的。在过去的几年中，随着相机分辨率和速度的提高，以及新的成像技术的发展，如光片和超分辨率技术，数据采集的速度急剧增加，需要更多的计算能力。因此，正确的数据和文件管理对于准确性和可重复性至关重要。一个典型的数据处理问题是无序。无规则或不一致的命名会导致多个问题，比如数据管理混乱，查找需要花费时间。这不仅对研究人员有影响，也让同行很难重复该实验。一个常见的例子是，研究人员离职后，留下了描述不清的笔记。同事们几乎没有任何重复成像实验的指导，导致了时间和金钱的浪费。首先，应该有一个一致的文件命名和组织系统。例如，每个实验都应该有一个单独的文件夹，上面标有实验的日期或图像采集以及实验的简短描述。例如“2022-01-01_more_cell_movies”。
图9 左侧的命名方式混乱，没有规则，右侧统一命名规范其次，使用电子文档、电子表格和/或实验室数据库等资源将每个人的笔记保存为一个统一的标准，并且所有实验室成员都可以访问或者可追溯。最后，可以使用文本文件并存储在对应文件夹中，对文件夹的内容、使用的成像参数和处理步骤进行注释。在文件命名中没有记录的其他细节也可以在这里注明。为了清晰起见，这些文本文件可以与实验室笔记本或电子表格进行交叉引用。从头就做好数据管理将在出版时带来帮助，而且越来越多的期刊要求作者分享完整的原始数据集作为发表的条件。光学显微镜是细胞生物学中一个强大的工具。为了正确地使用它，了解成像实验的每一个步骤，从实验设计到数据呈现和文件管理，在如实地观察和报告生物现象以及可重现性方面发挥不可或缺的作用。这里提出的指导方针绝不是面面俱到的。每个成像实验都有其自身的挑战，通过查询已发表的文献、咨询您所在领域的专家或您所在机构的显微镜工作人员，都能够提供有意义的实验设计指导。通过对他们的建议进行简单的调整和仔细的记录可以很容易地增加成像方法的严谨性，这是每个使用荧光显微镜进行研究的人都可以做到的。Lee J Y, Kitaoka M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell, 2018, 29(13): 1519-1525.Johnson J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol Biol Cell. 2012 Mar;23(5):754-7.Chiba, Kyoko, et al. Simple and direct assembly of kymographs from movies using KYMOMAKER. Traffic 15.1 (2014): 1-11.
